|
УДК: 616-07:061.62
Год издания: 1999
РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-CИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИЧ МЕТОДОМ ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА
Владыко А.С., Школина Т.В., Сурикова Л.Е., Кучеров И.И., Подольская И.В., Рытик П.Г.
Рубрики: 76.03.41, 76.35.33
Тема НИР: “Разработка современных тест-систем для диагностики клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, СПИДа. Получение рекомбинантного антигена вируса ЛХМ”.
Сроки выполнения НИР: январь 1996 г. - декабрь 1998 г.
Научный руководитель: д-р мед. наук А.С. Владыко.
Быстрая и экономичная скрининговая диагностика вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) особенно актуальна в связи с резким возрастанием числа больных и ВИЧ-инфицированных среди населения некоторых областей Беларуси.
Для анализа антител к ВИЧ была апробирована диагностическая тест-система на основе использования метода дот-иммуноанализа (дот-блот), который в отличие от ТИФА может выступать в роли как скринингового, так и подтверждающего теста.
Дот-иммуноанализ основан на иммунохимической реакции антиген - антитело. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью антивидового конъюгата после добавления нерастворимого субстрата, образующего окрашенные (коричневые) пятна различной интенсивности в местах связывания антигена и антитела.
Основой тест-системы является иммобилизованный на полоске нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ), приготовленный специальным образом инактивированный, концентрированный и очищенный антиген ВИЧ.
Одной из важных проблем в процессе создания диагностикума была отработка этапа блокировки свободных после сорбции пятна антигена мест на НЦМ. С этой целью были использованы бычий сывороточный альбумин (БСА) и неионные детергенты (NP-40, Твин-20). При использовании 0,1%-ного NP-40 полностью отсутствовало фоновое окрашивание мембраны, но наблюдалось сильное понижение чувствительности тест-системы. При применении в блокирующих растворах 3%-ного БСА в сочетании с 0,5%-ным Твин-20 отмечено полное отсутствие фона и наличие интенсивно окрашенного коричневого пятна. Была также выявлена зависимость эффективности связывания антител с иммобилизованным на НЦМ антигеном от времени инкубации. Так, при инкубировании в течение 1 часа окрашенное пятно было едва заметным. Наиболее интенсивное окрашивание пятна наблюдалось при инкубации в течение 2 часов. Дополнительная инкубация в течение ночи не приводила к увеличению интенсивности реакции.
При отработке оптимального состава субстратного раствора, используемого для окрашивания продуктов реакции, применяли 4-хлор-1-нафтол (ХН) и диаминобензидин (ДАБ). При использовании ХН отсутствовало фоновое окрашивание мембраны, однако и пятно было еле заметным. Применение же ДАБ было более эффективным: отмечался слабый фон, но окраска самого пятна была интенсивной.
В результате работы была апробирована экспериментальная диагностическая тест-система, с помощью которой выявлялись антитела к ВИЧ в сыворотке крови человека методом дот-иммуноанализа. По чувствительности и специфичности она не уступает ни ТИФА, ни иммуноблоттингу.
Область применения: клиническая и лабораторная диагностика.
Рекомендации по использованию: тест-система может применяться в диагностических лабораториях ЛПУ РБ.
Предложения по сотрудничеству: экспериментальное производство тест-системы, совместные разработки и внедрение.