Парэховирусы (ПЭВ) - широко распространенные, но малоизученные патогенные агенты. По спектру клинических проявлений парэховирусная инфекция (ПЭВИ) сходна с энтеровирусной: она может сопровождаться слабыми субклиническими признаками респираторной или кишечной инфекции, но вместе с тем может быть и причиной тяжелых форм, включающих менингиты, энцефалиты и сепсисоподобные заболевания. Так, от 3 до 17 % нейроинфекций у новорожденных и детей первого года жизни могут быть вызваны ПЭВ (для сравнения - вклад энтеровирусов составляет 14-19 %).

«Золотым стандартом» диагностики ПЭВИ в настоящее время является полимеразная цепная реакция со стадией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) с идентификацией продуктов реакции гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени.

До начала представленных исследований диагностика ПЭВИ в Республике Беларусь не проводилась. В связи с этим какая-либо информация о распространенности данной инфекции в человеческой популяции и ее вкладе в этиологическую структуру инфекционной заболеваемости в нашей стране отсутствовала. Основная причина этого была связана с неразработанностью отечественной методической базы, необходимой для выявления ПЭВИ и идентификации ее этиологического агента.

Цель исследования - разработка алгоритма диагностики ПЭВИ человека с последующим изучением ее вклада в развитие различных клинических форм у детей.

Первый этап работы был посвящен созданию методики обнаружения ПЭВ с помощью ОТ-ПЦР. В результате выполненных исследований разработан комплект праймеров и зондов для детекции ПЭВ, локализованных в 5’НТР участке генома вируса, содержащем консервативный сайт связывания с рибосомами, оптимизированы условия реакции. Далее сконструирована положительная контрольная проба К+ПЭВ. Для этого фрагмент-мишень для ОТ-ПЦР размером 194 п.о. был клонирован в составе вектора pJET1.2 в клетках E. coli DH5a. После подтверждения наличия в плазмидной ДНК специфической вставки методами ПЦР и секвенирования, векторная конструкция pJETparehAN использовалась в качестве положительной контрольной пробы К+ПЭВ. Для внутреннего контроля реакции в методику был введен коммерческий препарат ВКО, входящий в состав «Набора универсальных контрольных образцов для детекции РНК-содержащих вирусов методом ОТ-ПЦР» (Республика Беларусь).

Исследование аналитических характеристик созданной методики обнаружения ПЭВ с помощью ОТ-ПЦР показало, что порог ее чувствительности составил 10³ ГЭ/мл pJETparehAN. Специфичность методики определяли с использованием проб клинического материала, для которых было заведомо известно о присутствии в них энтеровирусов (n = 67), ротавирусов А (n = 52), норовирусов 2 геногруппы (n = 104), аденовирусов (n = 51), норовирусов 1 геногруппы (n = 7), саповирусов (n = 5 ). Выполненные исследования показали отсутствие ложноположительных результатов - все вышеуказанные пробы оказались отрицательными, что свидетельствовало о 100 % специфичности реакции.

Разработанная методика ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации ПЭВ, а также результаты лабораторных исследований биологического материала пациентов с различными клиническими формами ПЭВИ были положены в основу разработки алгоритма диагностики ПЭВИ. Данный алгоритм включает поэтапную последовательность действий с указанием показаний для его применения, виды исследуемого биологического материала в зависимости от клинической формы ПЭВИ, способы его взятия, транспортировки и хранения. Технология реализации алгоритма включает следующие основные этапы: получение проб и пробоподготовка, выделение парэховирусной РНК, реакция обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени, молекулярное типирование нуклеотидных последовательностей ПЭВ.

В ходе апробации разработанного алгоритма с использованием биологического материала пациентов с клинически подозреваемой ПЭВИ (n = 886) генетические маркеры ее возбудителя были выявлены у 4,4 % обследуемых. Среди пациентов с диарейным синдромом ПЭВИ была диагностирована у 6,3 %, с клиническими симптомами везикулярного фарингита с экзантемой или без нее - у 4,1 %, с клиническими признаками острой респираторной инфекции - у 4,4 % (от общего количества всех обследованных). У 180 пациентов с нейроинфекциями (менингит, менингоэнцефалит, менингеальный синдром, энцефалит) ПЭВИ не была выявлена. В группе лиц с другими клиническими диагнозами (n = 70), позволяющими предположить ПЭВИ (сепсис, гепатит, инфекционный мононуклеоз неустановленной этиологии, неуточненная вирусная инфекция и др.), ПЭВ были выявлен у 2,9 % обследованных.

По результатам молекулярного типирования выявленных возбудителей ПЭВИ идентифицировано их 4 типа: ПЭВ1 (84 %), ПЭВ4 (8 %), ПЭВ3 (4 %), ПЭВ5 (4 %). Подавляющее большинство ПЭВ1 (95 %), а также ПЭВ5 были детектированы у пациентов с кишечной инфекцией, ПЭВ4 - с симптомами везикулярного фарингита, ПЭВ3 - с острой респираторной инфекцией (11 человек).

Доминирующие в генетической структуре ПЭВ1 относились к генотипу ПЭВ1a. Изолят ПЭВ3 имел 99,6 % сходство со штаммом ПЭВ3 генетической линии Australia_2013-GL2015, вызвавшей многочисленные вспышки сепсиса у новорожденных в Австралии в 2013-2015 гг.

При изучении возрастной структуры пациентов с ПЭВИ установлено, что преобладающей группой были дети до 3 лет, которые составили 92,3 %.

Полученные результаты о реальном вкладе ПЭВИ в структуру инфекционной заболеваемости неустановленной этиологии свидетельствуют о необходимости скорейшего внедрения созданного алгоритма ее диагностики в широкую практику работы отечественной лабораторной службы.