В последние десятилетия одним из наиболее широко используемых методов лабораторной диагностики кишечных вирусных инфекций является полимеразная цепная реакция (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов реакции в режиме реального времени. Для снижения трудоемкости и повышения эффективности диагностики активно разрабатываются диагностические наборы, основанные на методах амплификации нуклеиновых кислот в мультиплексном формате. При этом перечень детектируемых возбудителей оптимизируется в зависимости от спектра доминирующих в определенном регионе вирусов и их вклада в этиологическую структуру острых кишечных инфекций (ОКИ). По результатам регулярно осуществляемого молекулярно-эпидемиологического мониторинга за вирусными ОКИ для Республики Беларусь наиболее актуальными и социально значимыми их этиологическими агентами являются ротавирусы (28,0%), норовирусы II геногруппы (22,3%), аденовирусы F (16,2%), энтеровирусы (7,7%), норовирусы I геногруппы (4%).

В настоящее время на отечественном рынке присутствуют мультиплексные ПЦР тест-системы российского производства («АмплиСенс® ОКИ скрин-FL» и «АмплиСенсRotavirus/Norovirus/Astrovirus-FL»), цена которых довольно высока, а по спектру выявляемых возбудителей вирусных ОКИ они не являются оптимальными для использования в практических лабораториях при установлении этиологии, путей и факторов передачи спорадической и групповой кишечной заболеваемости. В частности, они не позволяют проводить исследования по обнаружению энтеровирусов, актуальность детекции которых при расследовании эпидситуаций связана не только с их определенным этиологическим вкладом в структуру ОКИ, но и индикаторной ролью при санитарно-вирусологических исследованиях воды и пищевых продуктов. Кроме того, экономически и технологически неоправданной представляется комплектация российских мультиплексных ПЦР тест-систем набором реагентов для выявления ряда бактериальных возбудителей. Как известно, в рутинной практике для этого применяются бактериологические исследования, которые, как правило, проводятся параллельно в комплексе осуществляемыми лабораторными работами.

Цель настоящего исследования - разработка современной технологии производства мультиплексной ПЦР тест-системы для индикации возбудителей (рота-, норо-, адено- и энтеровирусов) актуальных кишечных вирусных инфекций.

Первый этап исследований был посвящен разработке схем праймеров и зондов, включающих 15 праймеров и 7 зондов для одновременной детекции ротавирусов А, аденовирусов F, норовирусов I и II геногруппы и энтеровирусов. В ходе исследований по оптимизации условий реакции определены оптимальные сочетания этих праймеров для детекции каждого возбудителя. Установлена оптимальная концентрация ионов магния (6,0 mM) и температура отжига праймеров (56°С). Проведены сравнительные исследования двух- и одностадийной ПЦР, результаты которых показали, что оптимальным является использование ДНК-полимеразы с ревертазной активностью. На основании экспериментальных результатов получено предварительное обоснование формата мультиплексной ПЦР и сформированы пары комплектов праймеров для детекции различных возбудителей в одной пробирке: ротавирус А/норовирус 2 геногруппы, аденовирус F/энтеровирус и норовирус 1 геногруппы/ВКО.

Испытания препарата армированной РНК, полученной с помощью пакующей системы бактериофага MS2, показали, что он может быть использован в качестве внутреннего контрольного образца в мультиплексной ПЦР.

В качестве положительных контрольных проб К+ при постановке ПЦР разработаны рекомбинантные векторы, которые содержали вставки-мишени геномов вирусов, выявляемых с помощью тест-системы: pJT2.1/RvA/988-1074NSP (содержит вставку фрагмента генома ротавируса А), pJT2.1/NoV2/4996-5100 (содержит вставку фрагмента генома норовируса II геногруппы), pJT2.1/NoV1/5321-5405 (содержит вставку фрагмента генома норовируса I геногруппы), pJT2.1/EV419-565 (содержит вставку фрагмента генома энтеровируса), pJT2.1/AdF1292-1397fib (содержит вставку фрагмента генома аденовируса F).

Получены рекомбинантные плазмиды pET20b/MS2/RvA, pET20b/MS2/NoV1, pET20b/MS2/NoV2, pET20b/MS2/EV для продукции АрРНК, содержащей фрагменты-мишени для ОТ-ПЦР в отношении ротавирусов А, норовирусов 1 и 2 геногруппы, энтеровирусов, которые играют роль ПКО при постановке реакции.

Для установления аналитической специфичности вышеописанной ПЦР-технологии проведены исследования 100 проб фекалий, в которых предварительно с использованием коммерческого набора «ОКИ-скрин» было установлено отсутствие ротавирусов А, аденовирусов F, норовирусов I и II геногруппы и энтеровирусов. Полученные результаты показали, что аналитическая специфичность составила 100%. Аналитическую чувствительность определяли с использованием 10-кратных последовательных разведений плазмид pJT2.1/RvA/988-1074NSP, pJT2.1/NoV2/4996-5100, pJT2.1/NoV1/5321-5405, pJT2.1/EV419-565, pJT2.1/AdF1292-1397fib, концентрация которых была определена спектрофотометрически. Согласно полученным данным аналитическая чувствительность ПЦР в отношении ротавирусов А, норовирусов I и II геногруппы и энтеровирусов составила 10³ ГЭ/мл, аденовирусов F - 10⁴ ГЭ/мл.

Таким образом, в ходе исследований решены следующие задачи:

- разработаны комплекты праймеров и зондов для одновременного выявления ротавирусов А, норовирусов I и II, адено- и энтеровирусов методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией продуктов реакции;

- оптимизированы условия ПЦР для достижения ее максимальной чувствительности и специфичности;

- разработаны образцы внутреннего, положительного и отрицательного контролей реакции, позволяющие контролировать все этапы исследований, начиная с выделения нуклеиновой кислоты;

- установлены аналитические характеристики ПЦР - чувствительность и специфичность.

Разработанная технология для одновременного выявления ДНК/РНК ротавирусов А, аденовирусов F, норовирусов I и II геногруппы и энтеровирусов далее будет использована для производства соответствующей мультиплексной ПЦР тест-системы.