Новой перспективной стратегией в репарации по­врежденных органов и тканей является тканевая инже­нерия. В данной стратегии трансплантат представляет собой ткань, созданную ex vivo, и состоящую из кле­ток на биосовместимом или биодеградируемом носите­ле, которая приживается и поддерживается в организ­ме реципиента. В настоящее время ведется активный поиск биосовместимых материалов, которые соответ­ствовали бы механическим параметрам органа на эта­пе заживления, а на более поздних этапах не препят­ствовали бы образованию полноценной здоровой тка­ни. Фибриновый гель - один из природных биоматери­алов, успешно используемый при создании имплантата сосудов, также обсуждается многими исследователями как потенциальный материал для восстановления хря­щевой ткани суставов.

Цель - изучить in vitro эффективность хондроген­ной дифференцировки мезенхимных стромальных кле­ток костного мозга (МСК КМ), заключенных в трех­мерную конструкцию из фибринового геля.

Ранее нами была получена трехмерная конструкция из МСК КМ, заключенных в фибриновый гель, пока­зана жизнеспособность клеток в данной конструкции. Известно, что выпускаемый различными производи­телями из плазмы крови коммерческий тромбин и фи­бриноген содержат примеси фибронектина, трансфор­мирующего фактора роста β₃, основного фактора роста фибробластов, эпидермального фактора роста и других активных биомолекул. Основные компоненты препара­та, а также их примеси могут модулировать дифферен­цировку стволовых клеток в пределах их дифферона. Для выявления влияния фибриновой матрицы на про­филь экспрессии маркерных генов хондрогенной диф­ференцировки изучали уровень экспрессии генов агре­кана (acan), коллагена I, II, IX (col1, col2, colIXa1), оли­гомерного матриксного протеина (comp) и декорина (dcn) в МСК КМ методом полимеразной цепной реак­ции (ПЦВ) в реальном времени. Коллаген II типа, агре­кан и коллаген IXa1 являются характерными маркера­ми хондрогенеза, в то время как коллаген I типа - спец­ифическим белком для таких тканей, как связки, руб­цовая и костная ткань. Декорин и олигомерный ма­триксный протеин (ОМП) связывают гликозаминогли­каны внеклеточного матрикса гиалинового хряща; кро­ме того, декорин может продуцироваться эндотелиаль­ными клетками при индуцированном воспалением ан­гиогенезе, а ОМП синтезироваться гладкомышечными клетками сосудов. В качестве контрольного (нормиру­ющего) гена использовали β₂ микроглобулин. Экспрес­сию генов изучали как в исходных МСК КМ, так и в клетках, подвергавшихся в составе трехмерной кон­струкции в течение 2-х недель воздействию следующи­ми дифференцировочными факторами: костным мор­фогенетическим белком-2 (КМБ-2) и трансформирую­щим фактором роста β₁ (ТФР-β₁). Чтобы выявить вли­яние фибринового матрикса на экспрессию хондроген­ных маркеров, параллельно культивировали клетки в составе конструкции без добавления регуляторных мо­лекул. Также отдельно изучали влияние компонентов фибринового геля, добавленных в культуральную сре­ду, на экспрессию вышеуказанных генов адгезирован­ными к пластику МСК КМ в двумерной культуре. В та­блице представлен уровень экспрессии генов клетками гиалинового хряща человека и МСК КМ после экспе­риментов относительно уровня экспрессии данных ге­нов исходными МСК КМ.

Проведенный анализ показал, что в дифференциро­ванных клетках хрящевой ткани уровень экспрессии основных маркеров хондрогенеза выше на 2 поряд­ка по агрекану и на 4 порядка по коллагену II типа по сравнению с исследуемыми исходными МСК КМ до начала экспериментов. При этом экспрессия коллагена I типа на 3 порядка ниже. При добавлении компонентов фибринового геля - тромбина и фибриногена в среду культивирования МСК КМ экспрессия генов acan и col2 уменьшалась в 3-7 раз, в то время как достоверно­го изменения по экспрессии col1 обнаружено не было. Нами, и другими авторами ранее была показана индук­ция экспрессии col1 в cтромальных клетках различного происхождения при двумерном адгезивном культиви­ровании на пластике. Помещение клеток в трехмерное окружение фибринового геля привело к почти пяти­кратному достоверному падению экспрессии col1 и подтвердило отрицательное влияние фибринового геля на экспрессию основных генов хондрогенеза - acan и col2, уровень которой уменьшился до 3-4% от исходно­го (табл.).

В то же время для других генов, вовлеченных как в хондро-, так и ангиогенез, значительного уменьшения уровня экспрессии мРНК не обнаружено. Более того, наблюдалось увеличение экспрессии генов comp и dcn в присутствии компонентов геля.

Примечание: p<0,05, н/и - не исследовалось.

Под действием регуляторных молекул экспрессия гена col2 увеличилась в 31 раз по сравнению с уровнем на момент начала дифференцировки и на 4 порядка по сравнению с экспрессией клетками, культивируемыми в фибриновом геле без добавления факторов. В свою очередь, экспрессия гена colIXa1, который также яв­ляется специфическим белком гиалинового хряща, практически не изменилась по сравнению с контроль­ными МСК, заключенными в фибриновую матрицу без добавления факторов роста. Одновременно с ростом экспрессии специфических коллагенов происходит не­которое уменьшение уровня экспрессии гена col1 - в 1,9 раза по отношению к МСК КМ, не подвергавшимся дифференцировке.

Таким образом, показано, что регуляторные факто­ры КМБ-2 и ТФР-β₁ индуцируют in vitro экспрессию присущего хрящу коллагена II типа, ОМП и декори­на (от 15 до более чем 1260 раз по отношению к ис­ходной экспрессии МСК КМ), однако слабо подавляют экспрессию коллагена I типа, индуцированного пред­варительным двумерным культивированием клеток. Установлено, что в отсутствие индукции хондрогенной дифференцировки внешними факторами фибриновый гель и его компоненты подавляют экспрессию колла­гена II типа и агрекана - двух наиболее характерных маркеров хрящевой ткани и повышают экспрессию других маркеров, вовлеченных как в хондро-, так и в ангиогенез, - декорина и ОМП, что делает данную матрицу более пригодной для эндотелиальной, нежели хондрогенной дифференцировки.