В настоящее время в сфере регенеративной медици­ны большие надежды возлагаются на применение ней­ральных стволовых и прогениторных клеток (НСПК) при лечении травматических и дегенеративных по­вреждений периферической и центральной нервной системы человека. Для клеточной терапии таких забо­леваний в последние десятилетия был использован ши­рокий спектр фетальных, эмбриональных стволовых и прогениторных клеток, однако определенные преиму­щества были выявлены у НСПК и глиальных обкла­дочных клеток обонятельной выстилки (ОВ) взрослого человека. ОВ является достаточно доступным источни­ком, из которого могут быть получены культуры НСПК и их дифференцированные потомки для дальнейшего применения в заместительной клеточной терапии.

Определенные сложности представляет приготов­ление культур клеток ОВ, так как на данный момент не существует единого протокола их выделения и культи­вирования. Имеющиеся методики выделения и культи­вирования клеток не всегда доступны, воспроизводимы и имеют ряд недостатков. В связи с этим, целью нашего исследования явилась оптимизация условий выделения и накопления биомассы клеток ОВ в условиях культу­ры и разработка технологии их приготовления.

Образцы ткани ОВ были получены из операционно­го материала, посылаемого на гистологическое иссле­дование при плановых хирургических вмешательствах у пациентов с патологией носа и околоносовых пазух. В основе разработанного нами протокола приготовле­ния культур клеток ОВ лежит методика Roisen et al. (2001) в нашей модификации. Установлены наиболее оптимальные условия ферментативно-механической диссоциации образцов тканей ОВ на отдельные клетки с сохранением их высокой жизнеспособности. Скомпа­нован состав ростовой среды на основе ДМЕМ/F12 с добавлением факторов роста и питательных веществ, обеспечивающих высокий пролиферативный потенци­ал клеток ОВ.

Формирование монослойной культуры, содержащей гетерогенную популяцию клеток ОВ, происходило в те­чение 10-14 дней. Морфологический состав клеток моно­слоя представлен в основном двумя типами: эпителиепо­добными и фибробластоподобными клетками. Выявлена популяция клеток, формирующая флотирующие структу­ры в виде сфер. В монослое отмечено появление очагов быстро делящихся клеток (рис.1), из которых единичные или кластеры с течением времени отделялись от поверх­ности культурального флакона и далее пролиферировали в суспензии, также давая начало сферам (рис. 2), клетки которых могут представлять собой пул НСПК клеток ОВ человека. В течение роста клеток в культуре отмечено установление равновесной системы из монослойной и су­спензионной частей. Выявлена зависимость степени про­лиферации их функциональной активности клеток сфер от присутствия монослойной части. В результате фено­типирования культивируемых клеток выявлены ГФКБ-, цитокератин 18-, фибронектин- и нестинположительные клетки. Эти данные свидетельствуют о присутствии в культурах клеток глиальной природы, клеток- предшественников эпителия и фибробластов. Наличие стволовых и прогениторных нейральных клеток было ха­рактерно для флотирующих сфер.

Таким образом, разработана технология выделе­ния и накопления биомассы клеток in vitro ОВ чело­века, особенностью которой является получение двух равновесно существующих систем клеток: рост их в монослое и суспензии, позволяющих получать гетеро­генную популяцию клеток, состоящих из НСПК, спо­собных к пролиферации и дифференцировке. Возмож­ность выделения и накопления в условиях культуры биомассы НСПК из ОВ явится основой для дальней­шей разработки протоколов лечения при повреждени­ях и дегенеративных заболеваниях структур нервной системы. К настоящему моменту продемонстрировано, что совместное культивирование стволовых клеток с ранним постнатальным эксплантом органа Corti вы­зывает формирование биполярных нейрофиламентов положительных нейронов, а трансплантация диффе­ренцированных клеток в оглушенную улитку млеко­питающего выявляет создание экзогенными нейрона­ми функциональных связей в оглушенной кохлеарной среде, что позволяет улучшить пороги слышимости при электростимуляции. Кроме того, перспективным также является изучение регенеративных процессов восстановления эпителиальных покровов верхних ды­хательных путей и барабанной перепонки при наличии стойких дефектов данной локализации с использовани­ем сконструированных различных клеточных компози­ций, состоящих из иммобилизованных в биодегради­руемые матрицы СНПК и клеток эпителия.

Трансплантация аутологичного или аллогенного, накопленного в условиях культуры, клеточного мате­риала с заданными фенотипическими свойствами по­зволит внедрить данную технологию и в другие обла­сти регенеративной медицины.

Рис. 1
Рис. 2