Рядом исследователей получены результаты, указы­вающие на возможность получения из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) нейрональных предшественни­ков с последующей дифференцировкой в различные типы нервной ткани (Kim S., 2006; Long X., 2005; Keene C.D., 2003). В то же время некоторые авторы (Ortiz-Gonzales X.R., 2004; Chen Y., 2006) сомневаются в возможно­сти подобного переключения стволовых клеток мезодер­мального происхождения и получения на их основе пол­ноценных нервных клеток, указывая на возможность ложно-положительных результатов при попытках нейро­генной дифференцировки МСК.

Цель работы - изучить возможность МСК костного мозга и пуповинной крови к дифференцировке в нейро­генном направлении, стабильность клеток к трансфекции и продукцию нейротрофинов.

Сущность достижения - определены условия диф­ференцировки МСК в нейрогенном направлении. С помо­щью молекулярно-генетического анализа и иммунотипи­рования показана активация экспрессии маркеров нейро­нальных предшественников и ранних нейронов. Адапти­рованы технологии химической трансфекции МСК, пока­зана способность синтеза нейротрофинов.

Новизна - полученные данные свидетельствуют о высокой пластичности фенотипа и профиля экспрессии нейрональных маркеров в МСК, культивируемых в ней­рогенных условиях, а также предполагают возможность дедифференцировки МСК, достигших стадии нейрональ­ных предшественников/ранних нейронов после удаления нейрогенных факторов. Показанная возможность транс­дукции МСК разными трансгенами и синтез ими нейро­трофинов позволит существенно расширить область их клинического применения.

В результате проведенных исследований установлено, что при культивировании МСК костного мозга доноров и пуповинной крови в нейрогенных условиях - пролифе­ративная среда NeuroCult (Stemcell Techn., Канада) с до­бавлением 20 нг/мл EGF, 10 нг/мл FGFb и 10 нг/мл гепари­на часть клеточной популяции приобретала определенные морфологические черты незрелых нейронов. Иммуноци­тохимический анализ показал, что такие клетки взаимо­действуют с антителами к раннему нейрональному мар­керу ?-III-тубулину. С помощью проточной цитометрии установлено, что содержание ?-III-тубулин-позитивных клеток составляет в среднем 18,3±6,5%.

Характерным признаком для незрелых клеток нерв­ной ткани является формирование флотирующих сфери­ческих агрегатов клеток, получивших название «нейрос­фер». Подобные формирования были получены нами при культивировании МСК костного мозга и пуповинной кро­ви в низкоадгезивных условиях. Образование нейросфер из МСК костного мозга существенно варьировало в зави­симости от донора и, как правило, на 7-й день дифферен­цировки не превышало 5-7 на 10 тыс. МСК. В пуповин­ной крови МСК характеризовались существенно более быстрым образованием нейросфер, их большим количе­ством и размерами. МСК пуповинной крови образовыва­ли на 2-4-й день культивирования 160-200 сфер на 10 тыс. МСК. Иммунотипирование нейросфер показало экспрес­сию нестина - общепринятого маркера нейрональных предшественников, что может свидетельствовать о запу­ске процессов ранней нейрогенной дифференцировки.

Молекулярно-генетический анализ МСК после 7 дней дифференцировки in vitro выявил активацию экспрессии таких маркеров нейрональных предшественников и ран­них нейронов, как nestin и neuron-specific enolase (NSE), а также раннего олигодендроглиального маркера myelin basic protein (МВР). При увеличении времени инкубации в нейрогенной среде до двух недель появлялась экспрес­сия маркера постмитотических нейронов МАР-2 и оли­годендроцитарный маркер dm-20. Экспрессия маркеров зрелых нервных клеток Olig2, plp, TH, AADC, GFAP и NFM в указанных экспериментальных условиях нами не выявлена.

Данные по экспрессии маркеров, полученных методом полимеразной цепной реакции и иммуноцитохимии сви­детельствуют, что при культивировании в нейрогенных условиях МСК костного мозга и пуповинной крови при­обретают определенные признаки ранней нейрональной дифференцировки. Однако при замене нейрогенной сре­ды на ?-модификацию среды МЕМ с 10% фетальной бы­чьей сывороткой (FBS) происходила достаточно быстрая (в течение 3-7 дней) реверсия фенотипа к обычному для МСК человека. При этом в течение как минимум 10 дней сохранялась экспрессия ранних и прогениторных марке­ров nestin, NSE и МВР. Иммуноцитохимия ревертирован­ных клеток показывала незначительную остаточную реак­тивность к ?-III-тубулину. При содержании в питательной среде 1% FBS реверсия фенотипа к обычному для МСК человека происходила в течение 4-5 недель.

С использованием стандартных методов молекулярно­го клонирования были созданы векторы экспрессии генов нейротрофинов (BDNF, NT-3, CNTF) в бицистронной кас­сете совместно с репортерным геном GFР. Векторы были введены в МСК костного мозга посредством липофекции с эффективностью около 30%. Трансфекция позволилa обеспечить экспрессию нейротрофинов и секрецию в сре­ду, что подтверждено методом ИФА.