Цель работы - определить пост-антигенную диффе­ренцировку В-лимфоцитов в периферической крови паци­ентов детского возраста с диагнозом «общий вариабель­ный иммунодефицит».

Общая вариабельная иммунонедостаточность (ОВИН) - это группа болезней, при которых нарушена продукция иммуноглобулинов и защитных антител, которые прояв­ляются повторяющимися обычно бактериальными инфек­циями, но не всегда. Общий признак - отсутствие анти­тел к патогену.

Термин «вариабельный» означает, что заболевание может манифестировать в различных возрастных пери­одах (детском, подростковом или юношеском), при этом степень выраженности и тип гипогаммаглобулинемии индивидуальны для каждого пациента. Частота встречае­мости - практически 1 на 10,000-100,000 человек. Сроки манифестации значительно варьируют, хотя чаще прихо­дятся на ранний детский возраст. Многие авторы описы­вают 2 пика манифестации: 5-10 лет и 3-4-я декада жиз­ни. ОВИН с равной частотой наблюдается у мальчиков и девочек. Большинство пациентов не имеет семейной исто­рии ОВИН, но они могут иметь родственников, страдаю­щих дефицитом IgA.

Иммунологические исследования: данные болез­ни характеризуются нарушением функционирования В-лимфоцитов, что приводит к снижению уровня IgG, IgA и/или IgM в сыворотке крови. Для пациентов с подо­зрением ОВИН уровень сывороточного IgG должен быть меньше нижней границы нормы, определенной для соот­ветствующей возрастной группы. Результат исследования иммуноглобулинов зависит от метода анализа, этниче­ской принадлежности, соотношения полов и возрастных особенностей референсной популяции. Несмотря на ши­рокую вариабельность уровня IgG у пациентов с ОВИН большинство пациентов имеет исходный уровень IgG меньше 4-5 г/л. Уровень IgМ также очень вариабельный; он может быть сниженным, нормальным или даже повы­шенным. Некоторые из этих пациентов могут иметь не диагностированный гипер-IgМ-синдром или дефект пере­ключения классов иммуноглобулинов.

Дополнительной возможностью для постановки диа­гноза «общий вариабельный иммунодефицит» может яв­ляться определение В-лимфоцитов памяти, которые фор­мируются у человека после завершения иммунного отве­та. Проточная цитометрия может быть использована для классификации пациентов с диагнозом ОВИН путем ис­следования субпопуляций В-лимфоцитов - EURO Class Classification. На сегодняшний день методом проточной цитометрии можно определить множество субпопуляций В-лимфоцитов в периферической крови, имеющих диа­гностическую значимость. Большинство пациентов име­ет нарушения в изотип-переключенных В-лимфоцитах па­мяти (IgM-IgD-CD27+) от снижения по сравнению с воз­растной нормой до полной редукции, что свидетельству­ет о нарушении в функционировании зародышевых (гер­минативных) центров.

С 2008 по 2010 гг. для 11 пациентов, 7 мальчиков и 4 девочек в возрасте от 5 до 20 лет с точным диагнозом «об­щий вариабельный иммунодефицит» (диагноз установлен согласно критериям Европейского общества по первич­ным иммунодефицитам; проведено как минимум два им­мунологических исследования с диапазоном в 6 мес. для исключения транзиторных состояний) была определена дифференцировка В-лимфоцитов периферической крови посредством изучения поверхностного фенотипа CD19+ лимфоцитов (CD19+CD27+IgD - изотип-переключенные В-лимфоциты памяти, CD19+CD27+IgD+ - непереклю­ченные В-лимфоциты памяти, CD19+CD27-IgD+ - наи­вные В-лимфоциты) методом проточной цитофлуороме­трии. Пациенты были разделены на две группы: дети в возрасте 5-12 лет (2 мальчика и 2 девочки, медиана воз­раста 8 лет) и 16-20 лет (5 мальчиков и 2 девочки, меди­ана возраста 18 лет) на момент определения наивных и В-лимфоцитов памяти. Данные больные (относительный состав субпопуляций В-лимфоцитов от всего пула CD19+) сравнивались с аналогичными возрастными группами здоровых детей. От родителей пациентов было получено информированное согласие для проведения иммунологи­ческого исследования.

Определение В-лимфоцитов памяти проводили следу­ющим образом: периферическую кровь (ПК) набирали в пробирки с консервантом (ЭДТА) в объеме от 2,5 до 5,0 мл в зависимости от клеточности образца. Цельную кровь разливали по 100 мкл в 5-миллиметровые полистирено­вые пробирки (Beckman Coulter, USA) и добавляли сле­дующие моноклональные антитела: контроль изотипа ан­тител, CD27 FITC 1 ?л, IgD PE 10 ?л (Pharmingen, USA), CD19 PC5 5 ?л (Beckman Coulter, USA). Образцы инку­бировались в станции пробоподготовки Beckman Coulter TQ prep (USA) 10 мин при комнатной температуре. За­тем автоматически станция раскапывала оригинальные (Immunoprep Reagent System - Beckman Coulter) лизиру­ющий и фиксирующий растворы в образцы, которые через 20 мин были готовы для записи на проточном цитофлуо­риметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter).

На рис. 1 представлены данные определения наивных и В-лимфоцитов памяти здорового донора и пациента с ОВИН.

На рис. 2 представлены результаты исследования от­носительного содержания субпопуляций В-лимфоцитов от всего пула CD19+ лимфоцитов в исследуемых группах пациентов и здоровых доноров.

В ходе исследования было выявлено достоверно зна­чимое снижение в обеих исследуемых группах (p=0,04 и p=0,0017) переключенных В-лимфоцитов памяти по срав­нению с данными здоровых детей, а также достоверно значимое увеличение (p=0,01) относительного содержа­ния наивных В-лимфоцитов (CD19+CD27-IgD+) в группе пациентов 16-20 лет.

С возрастом в норме число клеток памяти увеличи­вается после перенесения ряда инфекционных заболева­ний, но у пациентов с ОВИН после встречи с инфекцион­ными агентами нарушается постантигенная дифференци­ровка В-лимфоцитов.

Таким образом, в результате наших исследований разработана методология определения субпопуляций В-лимфоцитов. Показано достоверное снижение уров­ня переключенных В-лимфоцитов памяти у пациентов с ОВИН вне зависимости от возраста и достоверное увели­чение относительного содержания наивных В-лимфоцитов у больных с ОВИН 16-20 лет. Редукция В-клеток памяти нестрого специфична для ОВИН, она была описана для Х-сцепленного гипер-IgM-синдрома, синдрома Вискотт-Олдрич, Х-сцепленного лимфопролиферативного синдро­ма, идиопатической CD4-лимфопении, хронической гра­нулематозной болезни. Но у пациентов с гипогаммагло­булинемией и нормальным содержанием В-лимфоцитов в периферической крови при исключении вышеперечислен­ных иммунодефицитов это может являться важным и на­дежным маркером диагностики.