Цель работы - проанализировать текстуру хроматина и экспрессию генов, опосредующих программированную клеточную гибель, в лекарственно-чувствительных и устойчивых лимфоцитах при хроническом лимфоцитарном лейкозе (ХЛЛ).

Сущность достижения заключается в обнаружении в лекарственно-устойчивых и чувствительных лейкозных лимфоцитах дифференциальной экспрессии про- и антиапоптотических генов на фоне сохранения сходной общей структуры текстурных параметров хроматина, различия в которых могут быть выявлены только непосредственно после воздействия химиопрепаратов на клетки с неодинаковой чувствительностью к ним.

Новизна полученных данных определяется доказательством возможности характеризовать различия в лекарственной чувствительности лейкозных лимфоцитов по текстурным параметрам хроматина, ответивших на повреждение клеток, тогда как конститутивная экспрессия отдельных генов, участвующих в апоптозе, может предсказывать этот ответ.

Потеря опухолевой клеткой чувствительности к терапевтическим факторам опосредуется различными механизмами. Данный феномен имеет свое отражение на различных уровнях регуляции клетки, от экспрессии генов до хроматина, активность которых напрямую свидетельствует о процессах, протекающих в клетках. Более того, не исключено, что степень гомогенности и соотношение эу- и гетерохроматина в клетке могут быть связаны с изменением экспрессии генов, регулирующих функциональную активность клетки, в т. ч. и формирование устойчивости клеток к повреждающим воздействиям.

Объектом исследования служили образцы периферической крови 20 пациентов с ХЛЛ. Лимфоциты из периферической крови выделяли на градиенте фиколл-верографина. Чувствительность к действию лекарственных препаратов определяли с помощью теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромида (МТТ). Оценивали ответ на лекарственные препараты: флударабел в концентрации 5 мкг/мл, доксорубицин - 1 мкг/мл и винкристин - 0,5 мкг/мл. Включение в исследование данных лекарственных препаратов связано с их способностью, влиять на структуру хроматина клеточных ядер. Все образцы классифицированы на основании результатов МТТ: чувствительными к повреждающему воздействию химиопрепаратов считали клетки, выживаемость которых при действии всех химиопрепаратов была не более 35%, резистентными - не менее 70. Мультиплексную полимеразную цепную реакцию (набор Maxibio, США) использовали для определения экспрессии мРНК генов Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-xs, LICE, FLICE, Fas, FasL и TRAIL, участвующих в реализации программы апоптоза. Экспрессию генов анализировали и сопоставляли с экспрессией контрольного гена GAPDH. Анализ морфоденситометрических параметров клеточных ядер лимфоцитов осуществляли после окрашивания клеток акридиновым оранжевым. Получали снимки клеток на люминесцентном микроскопе Zeiss Axio Imager с объективом 50х/0.85, оборудованным фотокамерой Canon. На каждый исследованный случай обрабатывали не менее 100 клеточных изображений. Статистический анализ проводился в программе Statistica 6.0.

На основании лекарственной чувствительности in vitro сформировали группы, в которых изучали особенности экспрессии мРНК генов, регулирующих апоптоз, и параметры текстуры хроматина.

Рис. Экспрессия мРНК генов митохондриального (Bcl-2, Bcl-xl, Bcl-xs и LICE)(А) и рецепторно-опосредованного путей (FLICE, Fas и TRAIL)(Б) индукции апоптоза в клетках пациентов с ХЛЛ с различной чувствительностью к лекарственным препаратам in vitro

Установлено, что в резистентных ХЛЛ клетках по сравнению с лекарственно-чувствительными лейкозными лимфоцитами статистически достоверно повышен уровень антиапоптотического Bcl-xl и более чем в 2 раза снижено содержание мРНК LICE. При исследовании экспрессии мРНК генов, опосредующих апоптоз по рецепторному пути, показано снижение количества мРНК TRAIL по сравнению с чувствительными клетками ХЛЛ in vitro.

Таким образом, выявлена значительная экспрессия мРНК антиапоптотических факторов в лекарственно-резистентных клетках ХЛЛ при малом содержании мРНК генов, кодирующих белки, повышающие чувствительность клеток к апоптотическим сигналам.

При анализе изменения морфоденситометрических параметров структуры хроматина установлено, что текстурные параметры хроматина интактных флударабел-чувствительных и флударабел-резистентных лейкозных клеток непосредственно до воздействия препарата статистически достоверно не различались, однако текстурные параметры хроматина лимфоцитов после их культивирования с лекарственным препаратом обнаруживали значимые различия. Флударабел-устойчивые лимфоциты после культивирования с препаратом имели статистически достоверно большую площадь ядра, среднюю и интегральную яркость флуоресценции ядра по сравнению с чувствительными лейкозными клетками. Что касается анализа текстуры хроматина, то параметры «разбежка» и «нюанс» оказались на порядок больше в резистентных лимфоцитах. Эти параметры характеризуют сложность рисунка хроматина и фиксируют перепады яркости на соседних точках изображения, не воспринимаемые человеческим глазом. Исходя из этого, можно говорить о более однородной текстуре хроматина чувствительных клеток. В резистентных клетках также наблюдается увеличение параметров «корреляция», «энтропия», «контраст», описывающих соотношение эу- и гетерохроматина в ядре, что указывает на большую гетерогенность хроматина флударабел-устойчивых клеток.

Таким образом, основным признаком устойчивости клеток к действию флударабела является гетерогенная текстура хроматина. Более того, в лекарственно-устойчивых клетках наблюдается дисбаланс содержания мРНК, кодирующих белки апоптоза.