Проблема множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) M.tuberculosis (МБТ), т. е. устойчивости к изоназиду и рифампицину, остается чрезвычайно актуальной в течение последнего десятилетия во многих странах мира, в т. ч. в Республике Беларусь. Выявление возбудителя туберкулеза и определение его лекарственной чувствительности с использованием традиционных бактериологических методов требует до 3 мес., что обусловливает актуальность разработки быстрых методов детекции лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза. Выявление устойчивости к рифампицину используется в качестве маркера множественной резистентности микобактерий, поскольку, в соответствии с данными литературы, резистентность к рифампицину у 80-90% штаммов МБТ коррелирует с устойчивостью к изониазиду.

Целью настоящей работы являлась разработка тест-системы для диагностики туберкулеза и определения устойчивости к рифампицину методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

В ходе разработки тест-системы проведена оптимизация метода экстракции ДНК из проб диагностического материала от пациентов, подобраны праймеры и зонды, отработаны параметры ПЦР.

Последовательность исследований с помощью разработанной тест-системы включает взятие пробы диагностического материала; выделение ДНК микобактерий туберкулеза, находящихся в биологическом материале; проведение ПЦР для амплификации специфического генетического маркера M.tuberculosis - инсерционной последовательности IS 6110, а также 507, 516, 526, 531 кодонов rpoB гена микобактерий туберкулеза с одновременной гибридизацией с флюоресцирующими TaqMan зондами; анализ флюоресценции с помощью прибора ПЦР в реальном времени и интерпретация результатов.

Метод ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов показал возможность быстрой (6 ч) детекции МБТ и определения чувствительности МБТ к рифампицину у 87,2% МЛУ штаммов МБТ с профилем точечных мутаций, установленным методом секвенирования.

Лабораторные испытания разрабатываемой тест-системы с использованием заведомо чувствительных и устойчивых к рифампицину штаммов МБТ в сопоставлении с бактериологическими методами определения ЛУ выявили высокую чувствительность (90%) и специфичность (90%) детекции возбудителя туберкулеза и определения множественной лекарственной устойчивости МБТ с использованием разработанной тест-системы.